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2025年8月14日，Science发表标题为“Mitochondria protect against an intracellular pathogen by restricting access to folate”研究论文。本文通讯作者是德国科隆马克斯·普朗克衰老生物学研究所的Lena Pernas教授，其课题组致力于通过细胞器和新陈代谢功能分析，对传染病的机制进行探索与分析。本文中，研究者通过定量蛋白质组学与同位素示踪代谢组学技术，成功揭示了细胞通过线粒体限制叶酸（Folate）的利用对胞内寄生虫--弓形虫抵御机制。
为探究感染过程中重塑线粒体代谢的细胞程序，研究者将研究重点放在了线粒体 DNA（mtDNA）上。与其他细胞器不同，线粒体拥有自身基因组，这是其原核生物起源的遗迹。线粒体复制自身基因组时，依赖于胞质资源，例如由 B 族维生素叶酸维持的资源 。叶酸作为一种必需辅因子，参与胞质和线粒体中发生的一系列被称为一碳（1C）代谢的反应。这些反应对多种生化过程至关重要，包括嘌呤和脱氧胸苷一磷酸（dTMP）的合成 —— 而嘌呤和 dTMP 均用于生成 DNA 复制所需的脱氧核苷三磷酸（dNTPs）。因此，线粒体 DNA 的水平可反映线粒体对各类细胞资源的利用情况；此外，一碳代谢失调与脱氧核苷三磷酸（dNTP）库异常，均与线粒体 DNA 复制缺陷相关。多种胞内病原体的生长，同样需要依赖宿主细胞中一碳（1C）代谢下游产物。为此，宿主细胞已进化出限制一碳代谢物可利用性的防御机制，例如在病毒感染期间通过降解脱氧核苷三磷酸（dNTPs）来实现这一目的。然而，细胞是否会主动重编程线粒体，以阻止病原体获取与一碳代谢相关的营养物质，目前尚不明确。
为探究感染是否会导致宿主线粒体DNA（mtDNA）拷贝数变化，作者检测了感染I型弓形虫的人ES-2卵巢癌细胞中mtDNA水平。通过分析mtDNA调控区DLOOP及线粒体基因组不同位置的四个基因（mt-ND1、mt-ND6、mt-CYTB和mt-CO1），发现感染24小时后各基因拷贝数均增加约30%。为验证弓形虫感染是否促进mtDNA合成，我们使用胸苷类似物EdU标记新合成DNA，比较未感染与感染细胞中每个mtDNA核点的EdU焦点数量。结果显示感染使每个mtDNA核点的EdU焦点数增加，但未检测到胞质mtDNA及其引发的天然免疫基因（ISG15、IRF7）激活。这表明弓形虫感染特异性驱动线粒体内DNA水平升高。
弓形虫感染如何提升线粒体DNA水平？注意到感染同时诱导线粒体DNA转录因子TFAM和解旋酶TWNK的表达——这两种蛋白的适度过表达可使mtDNA水平提升约1.5倍，与在感染过程中观察到的变化幅度相当。推测mtDNA的增加受控于TFAM和TWNK上游某个感染诱导的转录因子。为验证这一假设，作者通过蛋白质组质谱分析比较了未感染与弓形虫感染细胞的全细胞蛋白提取物。感染使c-MYC、JUN、FOS等多种转录因子丰度增加，这与既往研究一致。然而激活转录因子4（ATF4）作为宿主转录因子诱导程度最高，在感染细胞蛋白质组中的富集度达约16倍。作者通过WB实验验证实验，分析对比了未感染与弓形虫感染细胞。结果显示，感染最早在6小时即可诱导ATF4表达，并在24小时达到峰值，且ATF4的核转位现象仅出现于感染细胞。
由于ATF4的靶基因会因其激活机制不同而变化，作者接下来致力于解析感染过程中ATF4上游的宿主信号通路。在整合应激反应（ISR）中，多种细胞应激信号被所谓的ISR激酶感知，进而使真核翻译起始因子2α（eIF2α）第51位丝氨酸发生磷酸化。这种翻译抑制随后触发ISR效应因子（如ATF4）的翻译。另一方面，ATF4也可被促生长信号通过激活代谢调控因子mTORC1来诱导。为明确感染过程中是ISR还是mTORC1介导了ATF4激活，作者构建了eIF2α磷酸化缺陷型（eIF2αS51A）小鼠胚胎干细胞。在野生型mESC中，与ES-2细胞类似，弓形虫感染和衣霉素处理均能诱导eIF2α磷酸化及ATF4表达。但在eIF2αS51A mESC或经ISR小分子抑制剂ISRIB处理的ES-2细胞中，两者均无法诱导ATF4。与此一致的是，通过雷帕霉素或torin1抑制mTORC1（以其靶标核糖体蛋白S6激酶1的磷酸化水平为评估指标）并未阻断弓形虫感染期间的ATF4激活。由此可见，感染通过ISR依赖性途径激活ATF4。为识别在感染和ISR激活过程中共同介导线粒体DNA水平升高的ATF4靶标，作者比较了未感染细胞、弓形虫感染细胞及衣霉素处理细胞中一组ATF4靶基因的表达。
弓形虫感染与衣霉素处理共同诱导的ATF4靶标包括转录因子ATF3和天冬酰胺合成酶（ASNS）。特别值得关注的是MTHFD2和SHMT2——这两个酶参与线粒体一碳代谢途径，以叶酸为辅酶激活并转移一碳单位，用于核苷酸前体的生物合成（。此外，MTHFD2已被证实与mtDNA缺陷相关。如预期所示，感染以ATF4依赖性方式诱导MTHFD2和SHMT2表达。
进一步，通过引入氘代标记的一碳代谢上游代谢物丝氨酸，他们确定，ATF4具有在感染期间维持宿主线粒体一碳代谢功能的作用。具体来说，ATF4敲除后，感染期间的dTMP水平显著升高，而这些升高的dTMP来自于寄生虫本身。dTMP是弓形虫生长的限制因素，而激活后的ATF4可以重构线粒体代谢途径，进而隔离携带一碳结构的叶酸，由此实现弓形虫生长的抑制。这一抵御寄生虫的效应同样可以在小鼠活体模型中，得以有效复刻与验证，进一步证明了结果的可靠性。
综上，本文中作者通过定量蛋白质组学与同位素示踪代谢组学技术，成功阐明了ATF4作为在寄生虫侵染过程中的核心传导元件，可以通过重塑线粒体中以叶酸为核心的一碳代谢过程，主动让线粒体夺取寄生虫的营养资源，进而实现寄生虫的抵御。这些发现为探索感染期间叶酸代谢的作用，以及线粒体对抗细胞内病原体的非经典防御机制建立了研究框架，具有重要意义。
